Da uno studio dell’ Università di biochimica e biofisica di Waltham, MA – USA con la divisione microbiologia, scienze della vita applicate della Gyeongsang National University – Facoltà di medicina, si evidenzia come elementi estratti dai frutti di Paulownia siano stati in grado di colpire il Coronavirus-SARS.
La proteasi simile alla papaina SARS-CoV (PLpro) è un importante bersaglio antivirale per via dei suoi ruoli chiave nella replicazione del virus SARS. Gli estratti MeOH dei frutti dell’albero di Paulownia hanno prodotto molte piccole molecole in grado di colpire il PLpro (coronavirus-Sars). Cinque di questi composti erano nuovi flavonoidi geranilati, tomentin A, tomentin B, tomentin C, tomentin D, tomentin E ( 1 – 5 ). Analisi della struttura di nuovi composti ( 1 – 5 ) per NMR ha mostrato che tutte contengono un 3,4-diidro-2H-pirano. Questo chemotipo è molto raro ed è derivato dalla ciclizzazione di un gruppo geranilico con funzionalità fenolica. La maggior parte dei composti ( 1 – 12) ha inibito il PLpro in modo dose-dipendente con IC 50 tra 5,0 e 14,4 μM.
La SARS è stata causata dal grave Coronavirus da sindrome respiratoria acuta (SARS-CoV), che è un virus a RNA a senso positivo a singolo filamento che si replica nel citoplasma delle cellule infette. La replica è mediata dalla poliproteina nella replicasi, che viene tradotta direttamente dal genoma virale e viene elaborata dalle proteasi del coronavirus presenti nella poliproteina della replicasi. Due proteasi della cisteina che risiedono all’interno della poliproteina, una proteasi simile alla papaina (PLpro) e una proteasi simile alla 3-chimotripsina (3CLpro), ciascuna catalizza il proprio rilascio e la liberazione delle altre proteine non strutturali dalla poliproteina. Questi processi sono obbligatori per la replicazione dell’RNA mediata da virus. Poiché questi ruoli fungono da fattori di virulenza necessari per l’infettività, il PLpro è considerato un bersaglio attraente per i farmaci antivirali.
La Paulownia è rinomata per essere una pianta ricca di polifenoli, utilizzati nella medicina tradizionale cinese. Questa specie appartiene alla famiglia delle scrophulariaceae. Il consumo di frutti di questa pianta è associato a una diminuzione della frequenza degli attacchi asmatici e mostra un effetto ipotensivo. Un estratto acquoso di frutta e foglie rigenera i capelli e stimola il cuoio capelluto. Iridoidi, lignani e flavonoidi sono stati precedentemente segnalati come composti bioattivi all’interno di P. tomentosa. Tra questi, i flavonoidi geranilati sono noti come i suoi principali componenti bioattivi. Alcuni studi hanno riportato che questa specie mostra attività citotossiche, antiossidanti e antimicrobiche. Recentemente, i flavonoidi geranilati di questa pianta hanno mostrato attività inibitorie nei confronti dell’acetilcolinesterasi e della butilcolinesterasi.
Sono stati quindi isolati dodici PLpro (Coronavirus SARS) flavonoidi inibitori di cui cinque sono emersi come nuovi flavonoidi contenenti un raro 3,4-diidro-2H-pyran. L’analisi di tutti i composti isolati nei test di inibizione del PLpro ha mostrato che tutte le specie erano in grado di inibire l’enzima, ma i nuovi composti erano i più efficaci.
A partire da un estratto con metanolo di frutti di Paulownia, sono stati purificati i composti che mostrano l’inibizione del PLpro mediante il frazionamento guidato dall’attività usando un test di attività PLpro SARS-CoV. I composti (1–5) sono emersi come nuovi derivati flavonoidi geranilati che sono stati chiamati: tomentin A (1), tomentin B (2), tomentin C (3), tomentin D (4) e tomentin E (5). Come mostrato nella Figura 1, i composti (6-12) sono stati identificati come estratti noti 3′-O-metildiplacolo (6), 4′-O-metildiplacolo (7), 3′-O-metildiplacone (8), 4 ′ -O-metildiplacone (9), mimulone (10), diplacone (11) e 6-geranil-4 ′, 5,7-triidrossi-3 ′, 5′-dimethoxyflavanone (12) confrontandoli con dati spettroscopici.
Figura 1: strutture chimiche dei flavonoidi isolati dai frutti di Paulownia
Per studiare la potenza inibitoria relativa dei dodici composti isolati ( 1 – 12) nei confronti del Coronavirus-SARS, ne è stata misurata la sua l’attività in presenza o in assenza di composti in esame mediante un test fluorogenico. Il SARpro-CoV PLpro (residui 1541-1855, corrispondente al dominio della proteasi) è stato espresso in Escherichia coli e purificato mediante affinità al nichel, scambio ionico e cromatografia di filtrazione su gel.
La costante apparente di Michaelis ( K m = 52 ± 0,9 μM) è stata determinata tracciando i tassi iniziali normalizzati alla concentrazione dell’enzima (52 nm) rispetto alla concentrazione del substrato (1–104 μM) e adattamento dei dati iperbolici mediante regressione non lineare utilizzando la modalità Michaelis-Menten nel diagramma di Sigma.
Nei test di inibizione del PLS SARS-CoV, tutti i composti testati hanno mostrato inibizione dose-dipendente (IC 50 5,0–14,4 μM, Tabella 3 ). L’inibizione di SARS-CoV PLpro in n. 2 , il flavonoide più potente ( K i = 3,5 μM), è illustrata in Figura 3 B, C e D, in modo rappresentativo. I grafici dell’attività residua dell’enzima rispetto alla concentrazione dell’enzima a diverse concentrazioni del composto 2 hanno dato una linea retta familiare con un’intercettazione dell’asse y pari a 0; questo indica che il n. 2 è un inibitore reversibile.
Le proprietà di inibizione dell’enzima dei composti target sono state modellate utilizzando grafici a doppio reciproco (analisi di Lineweaver-Burk e Dixon). Il risultato mostra una serie di linee, che si intersecano a sinistra dell’asse verticale e sopra l’asse orizzontale ( Fig. 3 C).
Questo implica che l’aumento di concentrazione conduce inibitore ad una diminuzione della V max e un aumento K m , indicando che il composto 2 è un inibitore di tipo misto. Pertanto, l’inibitore si lega a un sito allosterico sull’enzima. I valori di K i di tutti i composti sono stati misurati mediante il diagramma Dixon ( Tabella 3 ).
CONCLUSIONE
Sebbene il Coronavirus-SARS sia maggiormente associato agli scoppi nel 2002–2003, da allora ci sono stati diversi focolai. Pertanto, l’identificazione di nuovi composti con attività contro le proteine Cov-SARS è ancora di più grande importanza. È stato deciso di convalidare la pianta usata in medicina, Paulownia Tomentosa, come una ricca fonte di inibitori di SARS-CoV PLpro. Sono stati selezionati gli inibitori di questa proteasi perché è un promettente bersaglio farmacologico poiché l’enzima è necessario per numerosi processi nel ciclo di vita virale. La ricerca ha portato a prodotti naturali precedentemente non divulgati, che portano un insolito 3,4-diidro-2H-pyran. Si è scoperto che questa disposizione strutturale era più efficace nell’inibire l’enzima SARpro-CoV PLpro rispetto ai composti genitori che erano precursori della ciclizzazione. Ciò sottolinea chiaramente l’importanza di scoprire nuove o rare architetture dai prodotti naturali. Questi nuovi prodotti naturali possono essere di interesse generale per l’industria farmaceutica e per i chimici dei prodotti naturali.
Questa ricerca è stata supportata dal programma di sviluppo di tecnologie biologiche e mediche della National Research Foundation (NRF) finanziato dal governo (MEST) (n. 20110002235 con il supporto anche di una borsa di studio del programma BK21.
Geranylated flavonoids displaying SARS-CoV papain-like protease inhibition from the fruits of Paulownia tomentosa
Author: Jung Keun Cho,Marcus J. Curtis-Long,Kon Ho Lee,Dae Wook Kim,Hyung Won Ryu,Heung Joo Yuk,Ki Hun Park
Publication: Bioorganic & Medicinal Chemistry
Publisher: Elsevier Date: 1 June 2013
STUDIO COMPLETO IN LINGUA ORIGINALE: https://doi.org/10.1016/j.bmc.2013.03.027
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Ass.ne Paulownia Piemonte Nazionale
Resp. comitato scientifico: Dott. Berruti Daniele
Esperto facilitatore scientifico: Merlino Marcello
